Separação e cultivo de microrganismos

一, Separação e cultivo

Os microrganismos existem em um estado misto na natureza. Para obter as cepas desejadas, elas devem ser separadas delas. Se estiver contaminado acidentalmente quando for preservado, deve ser purificado. Existem muitos métodos para a separação e purificação de microrganismos, mas o princípio básico é semelhante. Ou seja, a amostra a ser separada é diluída até certo ponto, e as células (ou esporos) do microorganismo são mantidas em um estado disperso, tanto quanto possível, e então eles são cultivados em pura colônia única. No entanto, o trabalho acima é inseparável do processo de inoculação, que é transferir um microorganismo para outro meio esterilizado.

Material de classificação de inoculação microbiológica e ferramenta:

Incubadora de temperatura constante, anel de inoculação, haste de vidro, pipeta, lâmpada de álcool, meio de cultura, E. coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, levedura, etc.

Método de operação de inoculação:

1. Inoculação inclinada (conecte Staphylococcus aureus)

Antes de operar, limpe as mãos com 75% de álcool e acenda a lâmpada de álcool após o álcool volatilizar. Segure o tubo de deformação e a superfície inclinada entre o polegar esquerdo e os outros quatro dedos, de modo que a superfície inclinada e o lado com a tensão fiquem voltados para cima e na posição horizontal. Primeiro, gire a tensão e o tampão da inclinação para facilitar a retirada ao inocular. Segure o anel de inoculação em sua mão esquerda (como segurar uma caneta), esterilize a extremidade do anel na chama primeiro e depois esterilize-a estendendo-se para o resto do tubo de ensaio. Use o dedo anelar, o dedo mindinho e a palma da mão direita para retirar o tubo germinativo e o plugue de algodão ou a tampa do tubo de ensaio inclinado ao mesmo tempo, e depois esterilize lentamente a boca do tubo de ensaio (não queime muito quente). Estenda o anel de inoculação queimado no tubo de semente, entre em contato com o anel de inoculação na parede interna do tubo de ensaio ou o meio sem musgo, deixe esfriar o suficiente, em seguida, raspe suavemente um pouco de musgo e, em seguida, puxe-o para fora do anel de vacinação tubo. Estenda rapidamente o anel inoculado com bactérias para outro tubo de ensaio a ser conectado. Faça uma forma de "Z" da parte inferior da inclinação para cima e para baixo densamente. Às vezes, também é possível usar uma agulha de inoculação para puxar uma linha no centro do meio para inoculação oblíqua, de modo a observar as características de crescimento das bactérias. Após a inoculação ser concluída, a alça de inoculação é retirada e o tampão de algodão é inserido. Esterilize o anel de vacinação. Abaixe o laço de inoculação e aperte o plugue de algodão.

2. inoculação líquida

Conecte o meio inclinado ao meio líquido. Este método é usado para observar as características de crescimento das bactérias e a medição da reação bioquímica. O método de operação é o mesmo que antes, mas a boca do tubo de ensaio é inclinada para cima, de modo a evitar que o fluido de cultura flua para fora e conecte as bactérias, inocular Esfregue o anel e a parede interna do tubo algumas vezes para lavar as bactérias no anel. Após a inoculação, um tampão de algodão é inserido e o tubo de ensaio é suavemente batido na palma da mão para dispersar totalmente as bactérias. Inocular o meio líquido a partir do meio líquido. Quando a cepa estiver líquida, use uma pipeta estéril ou conta-gotas além do anel de inoculação. Ao inocular, basta retirar o plugue de algodão ao lado da chama, passar a boca do tubo através da chama, use uma pipeta estéril para sugar a solução bacteriana para a solução de cultura, e agite-o uniformemente.

3. inoculação da placa

Marque e espalhe as bactérias na placa. Inoculação de linha cruzada Veja o método de linha cruzada separado. Espalhamento e inoculação Injete a solução bacteriana na placa com uma pipeta estéril e cubra uniformemente a superfície da placa com uma haste de vidro esterilizada.

4. Vacinação

Inocular as bactérias no meio de cultura profundo sólido. Este método é usado para inocular bactérias anaeróbias ou observar o desempenho fisiológico ao identificar bactérias. O método de operação é o mesmo que acima, mas a agulha de inoculação usada deve ser reta. Perfure a agulha de inoculação do centro do meio de cultura até que esteja perto do fundo do tubo, mas não penetre e, em seguida, retire lentamente a rota de punção original.

Método de operação de Separação:

1. método de separação de diluição

Dispersar a amostra separada ao mínimo por diluição contínua, depois extrair uma certa quantidade na placa e misturá-la com o meio de ágar que é adequado para a fusão, de modo que as bactérias dispersas sejam fixadas no lugar para formar uma única colônia. Escherichia coli ou levedura é preparada com água estéril como uma suspensão bacteriana. Tome vários tubos de ensaio estéreis, cada um contendo 9ml de água estéril. Pipeta 1ml da suspensão bacteriana preparada e coloque-a no primeiro tubo de ensaio contendo 9ml de água estéril, de modo que seja diluída 10 vezes, o que é 10-2. Desenhe 1ml do primeiro tubo de ensaio (10-2) e injete-o no segundo tubo de ensaio contendo água estéril, de modo que seja diluído 100 vezes, o que é 10-2. Operar da mesma maneira até que seja diluído para 10-5-10-6. Desenhar com precisão 0,2 ml da solução bacteriana de cada diluição a 10-5-10-6 e adicioná-lo ao prato estéril vazio numerado. Repita a mesma diluição para fazer três pratos. Despeje o meio de ágar que foi derretido e resfriado a 45 em cada uma das placas acima mencionadas, gire suavemente para misturar completamente o meio e a suspensão bacteriana, após a solidificação, coloque-o em uma incubadora de 37 ou 38 graus e incubar por 24-48 horas, observe o crescimento e a distribuição das colônias na placa.

2. Método de separação de escriba de cama plana

O método de separação de estrias de placas é um método para separar microrganismos dividindo o anel de inoculação na superfície do meio da placa por zoneamento. O princípio é diluir a amostra microbiana "de ponto a linha" na superfície do meio sólido várias vezes para atingir o propósito de separação. Despeje o prato Dissolva o extrato de carne de ágar peptona médio, despeje o prato e deixe repousar horizontalmente até endurecer. Queime o anel de inoculação na chama da lâmpada de álcool e aguarde o resfriamento, tome um líquido misto de inoculação de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Segure a placa de ágar na mão esquerda e levante ligeiramente a tampa, enquanto se aproxima da chama. Segure o anel de inoculação à direita e estenda para dentro do prato. Faça uma linha de escriba em uma área na placa. O anel de inoculação é 30-40 ° da superfície da placa. Toque suavemente no ângulo e use a força do pulso para deslizar levemente na superfície. Não risque ou incorpore a superfície do comprimido na base. Queime o copo de inoculação para matar o líquido bacteriano restante no anel de inoculação. Após o resfriamento, estenda o anel de inoculação no prato. Depois de fazer um pequeno contato com a linha cruzada na primeira área, vire 90 °. As duas áreas continuam a ser atravessadas. Após a marcação, inocular o copo de inoculação, após o resfriamento, use o mesmo método para desenhar linhas em outras áreas. Depois que todas as linhas estiverem marcadas, use um lápis especial na parte inferior do prato para indicar a tensão, data, grupo e nome. Coloque a placa de Petri inteira de cabeça para baixo e coloque-a em uma incubadora de temperatura constante. 37 Após 24-48 horas de cultivo, retire e observe. Preste atenção às características do interruptor de colônia, tamanho, cor, borda, estrutura de superfície, transparência, etc.

三. Precauções:

1. a sala de inoculação deve ser mantida limpa, esfregar as bancadas e paredes com líquido de sabão fenol pulverizado, e fumigar regularmente com ácido láctico ou formaldeído. Antes de cada uso, deve ser esterilizado pela lâmpada UV. Verifique regularmente a esterilidade da sala de inoculação. Antes de entrar na sala de vacinação, a higiene pessoal deve ser feita primeiro, e sapatos de trabalho, chapéus, roupas de trabalho e máscaras devem ser substituídos na sala de proteção. Roupas de trabalho, sapatos de trabalho e máscaras só podem ser usados na sala de vacinação. Não é permitido ir a outros lugares e deve ser substituído e desinfetado regularmente. Os tubos de ensaio, triângulos e garrafas inoculados devem ser marcados com o nome e a data do meio de cultura e da cepa. Todos os itens movidos para a sala de inoculação devem ser limpos com 70% de álcool na sala de proteção. Antes da inoculação, esterilize ambas as mãos com 70% de álcool ou Xinjieer, não deixe a chama da lâmpada de álcool durante a operação; o tampão não é colocado aleatoriamente; as ferramentas de inoculação precisam ser esterilizadas por chama antes e depois do uso.

2. a incubadora deve ser limpa e desinfectada com frequência.